İmmünohistokimya (IHC) nedir?
İmmünohistokimya (IHC), histoloji ve immünolojinin bir kombinasyonudur. Diğer immünoloji teknikleri gibi üç önemli bölümden oluşur: antikorlar, izlemeye yönelik sinyal üretim sistemleri ve reaksiyonların yürütüldüğü katı faz. Bu kelime ilk başta korkutucu görünebilir, ancak onu doku anlamına gelen “histo” ve bağışıklık sisteminin tedavilerini ifade eden “immüno” gibi daha küçük parçalara ayırırsanız, Have hakkında genel bir anlayışa sahip olabilirsiniz. bu kelime.
Bu yöntemde dokuda spesifik bir antijenin varlığı veya yokluğu, antijene spesifik bağlanan bir antikor kullanılarak kontrol edilebilmektedir. Bu bağlantı doğrudan (tek adımlı) veya dolaylı (iki adımlı) olabilir.
Antikorlar ve antijenler bir kilit ve anahtar gibi çalışırlar, bu mekanizmada her kilit için özel bir anahtar bulunur. Belirli bir antijen vücudunuza saldırdığında, karşılık gelen antikor onu yok etmek amacıyla ona bağlanır, böylece çoğalmasını, yayılmasını ve daha fazla hasara neden olmasını engeller.
Bu gerçeklerin keşfi, immünohistokimya kavramının tanımına yol açmıştır, çünkü bu yöntem, vücudun laboratuvar ortamındaki doğal sürecini taklit ederek bilim adamlarının, vücudun bağışıklık sisteminin saldırdığı belirli bir organ dokusu parçasında üretilen spesifik antikorları tanımlamasına olanak tanır. Savaşmak, tanımlamak ve incelemek için belirli antijenleri otomatik olarak serbest bırakır.
Direkt yöntemde, doku antijeninin spesifik antikoru enzime bağlanır.Enzimler, substratın yakınında ışık mikroskobu altında görülebilen renk üretir. Bazen enzim yerine boya kullanılır.
Dolaylı yöntemde ise antijene özgü antikor dokuya bağlanıyor, ardından birincil antikora bağlanan ve bir yandan da konjuge enzime bağlanan ikincil antikoru ekliyoruz. Bu, alt tabakanın ürettiği rengi artıracaktır.
Patoloji bölümündeki tıbbi teşhis laboratuvarlarında immünohistokimya, kanserleri teşhis etmek, hastalıkların patogenezini incelemek, hücrelerin doğasını ve doku tipini tanımlamak, olup olmadığını belirlemek için dokudaki biyobelirteçlerin varlığını kontrol etmenin ana yollarından biri olarak kullanılır. Kitlenin primer veya metastatik olması ve tedavi amaçlı prognostik vakalar olması Ayrıca araştırma laboratuvarlarında çeşitli hücre içi ve hücre dışı belirteçleri kontrol etmek için de kullanılır.
Bu yöntemin avantajlarından biri de sağlıklı ve hastalıklı dokuların karşılaştırılmasına olanak sağlamasıdır, dolayısıyla bu uygulama bilim insanları ve patologlar için oldukça değerlidir.
İmmünohistokimyada (IHC) immün boyamanın en önemli avantajı doku ve yapıyı korurken bir doku örneğindeki hedefi görebilme yeteneğidir.
İmmünohistokimyasal süreç
IHC birkaç adımda yapılabilir. Öncelikle doku ve hücrelerin formaldehit adı verilen bir kimyasal kullanılarak sabitlenmesi gerekir. Bu sayede hücrelerin yapısal özellikleri sabitlenir ve her aşamada değişime uğramaları engellenir.
Öncelikle doku ve hücrelerin formaldehit adı verilen bir kimyasal kullanılarak sabitlenmesi gerekir. Bu sayede hücrelerin yapısal özellikleri sabitlenir ve her aşamada değişime uğramaları engellenir.
Bir sonraki adımda, antikorların dokuya girmesine ve hücrelerin içindeki epitoplara bağlanmasına izin veren Triton X gibi bir arındırıcı madde kullanılarak hücrelerin geçirgenleştirilmesi gerekir.
Birincil antikorlar proteine karşı eklenir ve ikincil antikorlar, birincil antikoru hedeflemek için FC alanlarına bağlanan yaban turpu peroksidazı (HRP) gibi enzimlerle eklenir.
HRP gibi enzimler, diaminobenzidin (DAB) gibi spesifik substrat moleküllerini hedefleyebilir ve farklı renklere sahip bir bileşikle sonuçlanan oksidasyonu katalize edebilir. Bu renkli bileşik, antikorun hedeflendiği bölgede kalacak ve hedef proteinin yakınındaki alanların, dokunun geri kalanından farklı bir renkle lekelenmesine neden olacaktır. Son olarak dokular, IHC kullanılarak daha iyi görselleştirme amacıyla lekeli doku ile lekesiz alanlar arasında kontrast oluşturmak amacıyla hematoksilen gibi bir boyayla şekillendirilir.
İmmünohistokimyanın amacı
IHC’nin en önemli amacı doku örneğinin hangi kısmında hangi spesifik antijenlerin kullanıldığını görebilmektir. Proteinlerin belirli bir noktada yoğunlaşması kanser ya da enfeksiyon hastalıkları gibi alanlarda tanı açısından önemlidir. Örneğin, IHC sıklıkla belirli meme kanseri türlerini teşhis etmek için kullanılır. Meme dokusunda bulunan HER2 reseptörünün aşırı ekspresyonu sıklıkla meme kanserinin büyümesi ve çoğalması ile ilişkilidir. Bunun nedeni HER2 reseptörlerinin büyüme faktörlerinden sinyal almasıdır.
Bu sinyaller, sonuçta hücre bölünmesine ve büyümesine yol açan hücre içi bir sinyal iletim yolunun yaratılmasına yol açar. İmmünohistokimya, doku örneklerinde HER2 tespit düzeyinin kontrol edilmesinde çok yararlı olabilir.
HER2 reseptörlerini antikorlarla hedefleyerek, onları substrat boyalarıyla lokalize ederek ve dokudaki reseptör seviyesini analiz ederek, hastanın mevcut durumu hakkında daha fazla kanıt toplanabilir ve muhtemelen spesifik kanser türleri tespit edilebilir.
Bir IHC testi tasarlarken hangi değişkenleri dikkate almalısınız?
Sabitleme adımı sırasında oluşturulan çapraz bağlantılar, antijene erişimi engelleyerek antikor bağlanmasını önleyebilir. Bu nedenle antijen geri kazanımı adı verilen bir yöntem kullanılarak çapraz bağların tersine çevrilmesi çok önemlidir.Antijen geri kazanımı, ısı veya enzimatik sindirim yöntemi kullanılarak sağlanabilir.
Birincil antikor, herhangi bir IHC tahlilinde önemli bir bileşendir ve veri kalitesi üzerinde doğrudan etkiye sahiptir. Zayıf veya yanlış bir birincil antikor, yorumlanamayan veya yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Bir antikorun IHC’de kullanımını doğrulamak için örnek dokuda birden fazla başarılı boyamaya ihtiyacımız var; Antikorun hedefi doğru bir şekilde tanıdığından emin olmak için ilgili antikorun doğrulanmış ve titiz bir yöntem kapsamında kullanılması gerekir.
Antikorlar için en uygun reaktifleri ve protokolleri kullanmak, sonuçlarınızı büyük ölçüde iyileştirebilir. Ayrıca tespit ettiğiniz sinyalin doğru olduğundan da emin olmalısınız.
Doku hazırlığı
Doku toplama, koruma ve sabitleme yöntemleri numuneye veya hedefe göre değişir. Doku toplama ve sabitleme, numune bütünlüğünü ve deney sonuçlarınızı doğrudan etkiler. Formalin gibi çapraz bağlayıcı fiksatif, dokunun bütünlüğünü ve dolayısıyla doku yapısını koruduğu için IHC için numune hazırlamak amacıyla sıklıkla kullanılır. Diğer bir seçenek de örnekleri dondurarak saklamaktır (kriyoprezervasyon). Fosforile edilmiş örneği kontrol etmek istiyorsanız bu daha iyi bir seçenektir.
Aperio Sitoplazma algoritması, hücrelerin sitoplazması içindeki bir protein biyobelirteci ile boyamayı modellemenize ve ölçmenize olanak tanır. Hücrenin immünohistokimyasının ayrıntılı bir resmi için hücre çekirdeği içindeki boyama transferini ölçerken, boyama alanını ve spesifik sitoplazmik belirteçlerin yoğunluğunu ölçmek için Aperio Sitoplazma algoritmasını kullanma.
Antijen alımı (Epitop)
Örneğin yapısal bütünlüğünü korumak için kullanılan fiksatiflerin dezavantajları vardır çünkü antikorunuzun tanımak üzere tasarlandığı epitopu itebilirler. Fiksasyonla tespit edilemeyen epitopları tespit etmek için çeşitli yöntemler vardır.
Bunlar arasında, proteinaz K gibi bir enzime dayanan proteolitik antijen geri kazanımı veya bağları kırmak ve proteinleri yok etmek için ısı kullanan ısı kaynaklı epitop alımı (HEIR) yer alır. Her iki yöntemde de epitoplar açığa çıkarılabilir ve birincil antikora erişilebilir ve IHC tarafından boyanabilir olarak değerlendirilebilir. Ancak bilim adamları, her bir antikorun IHC’de kullanılmasına yönelik en uygun koşulları belirlemek için çeşitli antijen geri alma yöntemlerini test ediyor.